EHA105(pSoup) Chemically Competent Cell

農(nóng)桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品標(biāo)簽：

EHA105菌株；農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；Rifampicin（Rif） 利fu平；Kanamycin（kan）卡那mei素；EHA101；LBA4404；GV3101；AGL1；植物轉(zhuǎn)基因研究；

產(chǎn)品訂購：更大包裝或產(chǎn)品技術(shù)問題，

產(chǎn)品描述：

EHA105菌株由EHA101菌株改造而來，染色體背景為C58，核基因含篩選標(biāo)簽—利fu平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒pEHA105（pTiBo542DT-DNA），此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA105（pTiBo542DT-DNA）質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能雖被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。在EHA105菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pSoup，即得到：EHA105 (pSoup)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制，同時(shí)賦予該菌株四環(huán)素（tetR）抗性，適用于水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。

我司（懋康生物）提供的EHA105 (pSoup)化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，基因型為C58 (rifR) Ti pEHA105 (pTiBo542DT- DNA) Succinamopine (pSoup-tetR)，經(jīng)pGs2質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA。

產(chǎn)品組分：

保存與運(yùn)輸條件：

保存：-80℃保存，1年有效。

運(yùn)輸：干冰運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-80℃，不可反復(fù)凍融和放置時(shí)間過長，以免降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

2） 整個(gè)轉(zhuǎn)化操作，嚴(yán)格根據(jù)相應(yīng)溫度及無菌條件要求進(jìn)行。

3） 加入質(zhì)粒的體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率急劇下降。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級。

4） 為確保轉(zhuǎn)化效率，整個(gè)操作過程應(yīng)盡量輕柔，并保持低溫。

5） 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終涂板用量。

6） 平板上克隆密度過大時(shí)，由于營養(yǎng)不足，克隆生長變慢，菌落變小。為獲得大菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

7） 培養(yǎng)基中加入利fu平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈mei素或慶大mei素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但鏈mei素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮鏈mei素或慶大mei素，因Ti質(zhì)粒丟失的概率極低（基本可以忽略）

8） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

1) 取-80℃保存的感受態(tài)細(xì)胞于室溫或手心片刻待其部分融化，達(dá)到冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰浴中使其完quan融化。

2) 往100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入0.01~1μg（體積不大于10μl）質(zhì)粒DNA，用手撥da管底使其混勻，依次于冰上靜置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。

【注意】：次使用，建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的用量。

3) 加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2-3h。

4) 6,000rpm離心1min，吸掉600ul上清，之后用槍輕輕吹打重懸菌體。之后加到含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，用無菌玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。室溫正置10 min，待液體被吸收后，倒置平板，28℃培養(yǎng)2-3天。

【注意】：當(dāng)平板只含50μg/ml卡那mei素時(shí)，28℃培養(yǎng)48h即可；當(dāng)平板中同時(shí)加入50μg/ml卡那mei素和10μg/ml利fu平時(shí)，需28℃培養(yǎng)48-60h；當(dāng)平板中同時(shí)加入50μg/ml卡那mei素和20μg/ml利fu平時(shí)，需28℃培養(yǎng)60-72h；不建議使用超過20μg/ml的利fu平用于平板或液體培養(yǎng)。

5）目的克隆的液體培養(yǎng)：

j小量搖菌：往15ml的圓底透氣試管中加入1ml含對應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，從新鮮培養(yǎng)的平板上挑1-2個(gè)單菌落接種，30℃，200rpm搖菌24-48h。

k大量搖菌：100ml透氣三角瓶內(nèi)加入少于20ml含對應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，取小搖菌液按2%比例接菌，30℃，200rpm搖菌24-48h。

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附表1固體和液體LB培養(yǎng)基配方

附表2固體和液體YEB培養(yǎng)基配方

附表3常見農(nóng)桿菌對抗生素敏感性總表

— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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