Zeocin (Powder) 博萊mei素

產(chǎn)品標簽

Zeocin 博萊mei素（博來mei素）；Phleomycin 腐草霉素；Sh ble基因；Hygromycin B潮霉素B；G418 遺傳霉素；CAS NO.：11006-33-0

產(chǎn)品信息

【提示1】：另現(xiàn)貨供應Invitrogen*的Zeocin（博來mei素）；

【提示2】：另現(xiàn)貨供應母液形式的Zeocin（博來mei素），使用更便捷，且價格更經(jīng)濟。

【提示3】：對Zeocin不敏感的細胞，如絲狀真菌和一些酵母菌，建議使用腐草mei素（貨號：MS0008-1ML），抗性基因同樣為Sh ble。

【提示4】：*含Zeo+基因序列的質(zhì)?！?pcDNA 3.1/Zeo（+）（Invitrogen of Thermo），序列圖譜點擊下載文檔。

產(chǎn)品描述

Zeocin是一種作用于真核和原核細胞的選擇性抗生素。來自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因賦予Zeocin抗性，該基因編碼一種13,665Da大小的蛋白，以化學計量方式結(jié)合Zeocin，抑制其DNA雙鏈切割活性。因此，能表達此蛋白的真核和原核宿主細胞具有Zeocin抗性。

Zeocin是腐草霉素D1（Phleomycin D1）的商業(yè)名稱，是一種銅離子螯合的糖肽抗生素（來源于鏈霉菌Streptomyces verticillus的突變株），銅離子的存在使其呈藍色，此銅螯合的形式為無活性。當抗生素進入細胞后，二價銅離子（Cu²⁺）被還原為一價銅離子（Cu⁺），并被細胞內(nèi)的巰基化合物去除。銅離子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其斷裂，終導致細胞死亡。Zeocin作用譜廣泛，對細菌、真核微生物、植物和哺乳動物細胞具很強的毒性。

本品以藍色粉末形式提供，低內(nèi)毒素水平，達細胞培養(yǎng)級。通常情況，哺乳動物細胞的篩選濃度范圍是50-400 µg/ml，細菌的篩選濃度為25 µg/ml。

我司還提供無菌溶液形式的Zeocin（貨號：MS0009-125MG，MS0009-1000MG），濃度是100mg/ml，使用起來更加方便，只需直接加入培養(yǎng)基到所需工作濃度即可。

產(chǎn)品特性

1） CAS NO.：11006-33-0

2） 外觀：藍色粉末

3） 內(nèi)毒素：＜1 EU/mg

4） 溶解性：易溶于水（>500 mg/ml）

5） 質(zhì)量控制：分別對Zeocin敏感或Zeocin耐性的哺乳動物細胞測定抗生素活性。

保存與運輸方法

保存： +4℃干燥保存，至少1年有效。

運輸：室溫運輸。

注意事項

1） Zeocin粉末容易受潮，一定要注意干燥保存。每一次使用完后需蓋緊管子。

2） Zeocin是一種不穩(wěn)定化合物，在高pH和低pH或存在弱氧化劑的情況下會發(fā)生不可逆變性。

3） Zeocin對高濃度酸和堿都很敏感，但短期暴露在弱酸下能耐受。

4） Zeocin對光敏感，需將抗生素，或含該抗生素的平板或培養(yǎng)基置于黑暗處。

5） Zeocin有毒，操作時需注意防護，切勿與身體或皮膚直接接觸。

6） Zeocin™是Invivogen公司的商標產(chǎn)品。

7） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

母液制備

1）將低溫保存的Zeocin置于室溫回溫至少20min，加入適量HEPES buffer（5g/L, pH 7.2±0.1），充分溶解，配制成100mg/ml溶液。2）用0.22µm濾膜過濾除菌。3）溶液置于4℃保存12個月有效，或-20℃保存，18個月有效。

操作步驟（以哺乳動物細胞為例）

【注1】：Zeocin的殺滅機制不同于新生霉素（neomycin）和潮霉素B（hygromycin B），細胞不會聚集成團和從培養(yǎng)板表面脫落。一旦接觸到Zeocin，敏感細胞會出現(xiàn)如下的形態(tài)變化：1）細胞體積明顯增加（類似于巨細胞病毒感染容納性細胞引起的腫大效應）；2）異常的細胞形狀包括細胞長臂（long appendages）出現(xiàn)；3）胞漿內(nèi)出現(xiàn)大型空泡（源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或支撐蛋白的破裂）；4）質(zhì)膜和核膜破裂，導致膜上出現(xiàn)許多孔。這些敏感細胞終會*破損，僅僅以細胞碎片的形式存在。

【注2】：Zeocin抗性細胞按正常周期分化產(chǎn)生不同于敏感細胞的克隆?？剐约毎谛螒B(tài)上，與未接觸Zeocin™的正常細胞沒有任何差異。

【注3】：Zeocin用于哺乳動物細胞篩選常用濃度為50-1000µg/ml（平均常用濃度為250-400μg/mL），影響篩選濃度的主要因素包括離子強度，細胞類型，細胞密度以及生長速率。以下步驟僅作參考，請根據(jù)自身實驗體系做適當調(diào)整。

一、細胞對Zeocin敏感性的確定（殺滅曲線建立）

• 重新鋪板或者將滿盤細胞重新分盤，使得細胞密度約25%，按照8個平板/組準備，培養(yǎng)24h，去除舊培養(yǎng)基。

• 加入含不同濃度Zeocin的篩選培養(yǎng)基，Zeocin濃度可設(shè)置為0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每個濃度做3個平行；也可根據(jù)自身實驗體系，設(shè)置不同的濃度梯度。

• 每3-4天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察存活細胞的比例。選擇在合適時間（1-2周內(nèi)）殺死大多數(shù)細胞的濃度為加工作濃度?！?/span>注】：若是難以在顯微觀察下區(qū)分活細胞，建議使用臺盼藍染色來計算存活細胞的數(shù)量，以確定Zeocin的適濃度。

二、篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系

• 轉(zhuǎn)染細胞，用100mm培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染的細胞作為陰性對照。

• 轉(zhuǎn)染后，用預熱的1X PBS洗滌一次，加入新鮮培養(yǎng)基。

• 轉(zhuǎn)染48-72h后，用含有加濃度Zeocin（由滅殺曲線確定）的新鮮培養(yǎng)基篩選細胞。為了更好的鑒定和篩選細胞集落，建議將細胞按比例稀釋成一系列濃度。

【注】：若待篩選細胞對Zeocin的抗性明顯強于大部分細胞，按照以下方法克服此類耐性：用含Zeocin培養(yǎng)基進行細胞分盤，置于37°C孵育2-3h，使得細胞貼壁。然后將細胞置于4°C，2h。記得使用Hepes作為培養(yǎng)基的緩沖體系。重新將細胞置于37°C孵育。4°C孵育細胞的目的是短時間內(nèi)終止細胞分化，使得Zeocin能發(fā)揮作用，殺死細胞。

• 每3-4天更換新鮮的選擇培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)細胞集落。

• 挑選并轉(zhuǎn)移克隆到96或48孔板中。在進行更大孔徑培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上擴大培養(yǎng)之前，確保培養(yǎng)細胞密度近。

三、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的維持培養(yǎng)

可采取以下方式維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞：

1）使用含相同劑量Zeocin的篩選培養(yǎng)基來維持培養(yǎng)；

2）降低Zeocin劑量為原來的一半進行維持培養(yǎng)；

3）使用正好能預防敏感細胞生長但不足以致死的Zeocin劑量來維持培yang【根據(jù)殺滅曲線來判斷】。

相關(guān)產(chǎn)品

附表一 某些哺乳動物細胞的Zeocin工作濃度

Zeocin常用的工作濃度為100μg/ml，但是，加的工作濃度需要根據(jù)細胞類型和實際的實驗體系來確定。某些哺乳動物細胞的建議工作濃度列在下表：

— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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Zeocin （Powder） 博萊mei素 抗生素

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