一、為什么我們需要酵母感受態(tài)細(xì)胞?
通常，在實(shí)驗(yàn)過程中需外源DNA引入到酵母細(xì)胞。引入基因片段(線性ssDNA或質(zhì)粒)是通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)的，具體方法有化學(xué)法，如醋酸鋰和聚乙二醇(PEG)或電穿孔法。有效的酵母轉(zhuǎn)化需要高質(zhì)量的酵母感受態(tài)細(xì)胞為開始。勝任力則是指細(xì)胞能吸收游離的細(xì)胞外的遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA)的能力。
二、酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備獲得感受態(tài)細(xì)胞相當(dāng)簡(jiǎn)單，但許多研究人員在實(shí)現(xiàn)良好的生存比例和轉(zhuǎn)換效率時(shí) 遇到問題。常見的誤區(qū)包括由于制備條件惡劣導(dǎo)致高的細(xì)胞死亡率，或由于無效的感受態(tài)細(xì)胞制備導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低。雖然酵母細(xì)胞和大腸桿菌一樣容易生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化，但它們需要不同的處理方法來制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化。酵母細(xì)胞像哺乳動(dòng)物細(xì)胞一樣，有類似的處理程序。典型的酵母感受態(tài)細(xì)胞制備方法如下:
1.過夜培養(yǎng)你想轉(zhuǎn)化的酵母菌菌株，使用營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基培養(yǎng)不含質(zhì)粒的細(xì)胞。
2.對(duì)于已經(jīng)含有質(zhì)粒的細(xì)胞，使用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基來維持質(zhì)粒。
3.當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1 - 2 x 107cells/mL，離心收獲細(xì)胞。細(xì)胞密度可以通過使用分光光度計(jì)在OD600檢測(cè)，或者使用血球計(jì)在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。
4.沖洗細(xì)胞，重懸于無菌水，離心，棄上清，重復(fù)此步驟兩次以*清洗細(xì)胞。zui后一次洗完，將細(xì)胞重懸于感受態(tài)細(xì)胞溶液，分裝，大約每管108個(gè)細(xì)胞，每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將使用這些數(shù)量的細(xì)胞。
5.分裝好的管子放于-80°C，供以后實(shí)驗(yàn)使用。在所有步驟中,使用質(zhì)量好的無菌過濾器消毒過的試劑,以防止污染問題。